石蠟切片神經組織金屬鋅蒂姆（TIMM）染色試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  石蠟切片神經組織金屬鋅蒂姆（TIMM）染色試劑是一種旨在使用標準化的化學分離石蠟方法和蒂姆硫化法銀染技術，分析存檔中的石蠟包埋的組織切片中神經系統中含鋅神經細胞結構的而經典的技術方法。該技術經過精心改良蒂姆（Timm）方法、成功實驗證明的。主要適用于石蠟包埋的腦組織或外周神經組織切片，例如海馬（hippocampus）中苔蘚纖維區（mossy fiber region）和齒狀分子層（dentate molecular layer）等含鋅神經細胞體，例如錐體細胞（pyramidal cells）、齒狀顆粒細胞（dentate granule cells）等檢測。廣泛用于腦理生理，尤其是癲癇等疾病的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

蒂姆硫化法銀染（Timm’s sulfide silver staining）是由蒂姆建立的用于觀察腦組織和其它組織中（例如胰腺、小腸、睪丸、腎臟等）微量金屬元素鋅，以及其它重金屬元素，例如銅、鎳、鈷和鐵等的染色技術。主要用于觀察中樞神經系統中含鋅神經元，以及新軸突分枝（sprouted axon）和軸突終端（axon terminal）等結構，分析大腦灰質內部的海馬中軸突終端（突觸泡囊synaptic vesicle）、苔蘚終端（齒狀顆粒細胞dentate granule cells）中的反應性鋅的分布，與突觸活性和膜去極化的關系，研究神經退行性和癲癇病理性變化機制。其原理在于使用硫化物，與組織中的游離金屬元素反應成為不溶性復合物沉積，進而在還原劑的作用下，金屬硫化物催化還原離子銀為可見金屬銀沉積，呈現黑色，即為金屬自顯影術（autometallography，AMG）。

產品內容

  硫化液（Reagent A）           毫升

  固著液A（Reagent B）          毫升

  固著液B（Reagent C）              毫升

  脫蠟液（Reagent D）                毫升（自備）

  補水液A（Reagent E）          毫升

  補水液B（Reagent F）          毫升

  補水液C（Reagent G）          毫升

  清理液（Reagent H）           毫升

  染色液A1（Reagent I1）              毫升

  染色液A2（Reagent I2）              瓶

  染色液A3（Reagent I3）              毫升

  染色液B（Reagent J）          微升

產品說明書              1份

保存方式

保存  染色液A1（Reagent I1）在—20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保證3月

用戶自備

PBS緩沖液：用于灌注

無離子水：用于組織清洗

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

無菌鑷子：用于轉移動物腦組織

小型玻璃染色缸：用于組織或切片處理的容器

切片機：用于組織切片

明膠化載玻片和蓋玻片：用于切片后鋪片

中性樹脂：用于切片封片

光學顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

實驗步驟

一、 樣本固著處理

1． 常規麻醉動物和手術（建議：使用PBS由心臟處灌注約5至10分鐘，去除血液直至澄清，肝臟顯示灰白）

2． 使用適量的  硫化液（Reagent A）灌注處理（建議：至少10分鐘，肝臟顯示發黑）

3． 即刻小心取出腦組織（組織顯示藍灰色調）

4． 小心放進xx毫升  硫化液（Reagent A）里

5． 室溫下浸泡孵育45分鐘

6． 即刻用無菌鑷子夾起組織塊 

7． 放進用戶自備的無離子水清洗2分鐘

8． 小心轉移到xx毫升  固著液A（Reagent B）里

9． 室溫下浸泡孵育過夜（16小時）

10． 小心轉移到xx毫升  固著液B（Reagent C）里

11． 室溫下浸泡孵育過夜（16小時）

12． 用綿紙吸干組織快

13． 即刻進行常規乙醇和氯甲烷（氯仿類）處理后石蠟包埋

14． 取出組織塊，進行緩慢石蠟切片，為10至50微米厚，并鋪片在明膠化載玻片上

二、 脫蠟處理

1． 取出10片待測的10至50微米厚的石蠟包埋的組織切片

2． 按下表依次放進小染色缸里孵育

5． 小心移去切片上的  清理液（Reagent H）

三、 樣本染色處理

染色開始前，將  染色液A1（Reagent I1）置于室溫下均衡溫度，然后移取xx毫升  染色液A3（Reagent I3）到1瓶  染色液A2（Reagent I2），充分混勻后，再加入到1瓶  染色液A1（Reagent I1）中，充分混勻；然后移取2毫升染色液A混勻液到2.2毫升離心管，加入xx微升  染色液B（Reagent J），混勻后，標記為  染色工作液（10張切片染色），置于暗室里備用。然后進行下列操作

1． 小心加上xx微升  染色工作液，鋪滿整個切片樣品表面

2． 室溫下孵育60至90分鐘，或直至呈現黑色，即可終止，避免光照

3． 小心移去切片上的  染色工作液

4． 室溫下，小心將切片置入xx毫升  清理液（Reagent H）中孵育5分鐘

5． 小心移去切片上的  清理液（Reagent H）

6． （選擇步驟）進行復染操作（建議使用  甲苯酚紫（CRESYL VIOLET）復染試劑盒－GMS80052）

7． 透明處理

8． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）

9． 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：含鋅神經細胞體，例如錐體細胞、齒狀顆粒細胞、突觸泡囊等，呈現黑色（如果復染――細胞核呈現藍色，胞漿尼氏（體）物質呈現粉紅至紫色）

注意事項

1． 本產品為10次操作，其中20次染色操作

2． 操作時，須戴手套

3． 鋪片須使用明膠化載玻片，否則染色會掉片：第一用毛筆涂刷；第二保持濕潤3小時；第三用PARAFIN包裹后壓片

4． 切片建議10至50微米，過厚和過薄不利于檢測神經細胞

5． 注意操作安全，尤其使用  固著液（Reagent B和C）和  脫蠟液（Reagent D）

6． 用戶可以使用二甲苯替代  脫蠟液（Reagent D）

7． 建議使用玻璃染色缸

8．   染色液A混勻液新鮮配制，不宜保存

9． 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干

10． 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面

11． 整個操作，在避光狀態下進行

12． 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察 

13． 樣品染色后保存，避免光照

14． 參考圖像如下

15． 本公司提供系列神經系統成分染色試劑產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定顯色清晰