細胞株開發(fā)（Cell Line Development, CLD）是生物藥物開發(fā)過程中一個極為關(guān)鍵也十分復雜的過程。一個優(yōu)質(zhì)的細胞株對于簡化CMC階段的開發(fā)流程和顯著減少藥物研發(fā)成本具有關(guān)鍵影響。為了闡明這一關(guān)鍵工作流程，BioPhorum的細胞株開發(fā)小組成員團隊制定開展了一項行業(yè)調(diào)研，調(diào)研結(jié)果以“When will we have a clone? An industry perspective on the typical CLD timeline“為題，發(fā)表在Biotechnology Progress期刊上。

這篇綜述為我們提供了深入的行業(yè)視角，探討了生物藥物細胞株開發(fā)（CLD）的復雜性，就CLD的挑戰(zhàn)和最佳實踐提供了寶貴的行業(yè)見解，旨在提高對生物治療藥物細胞株開發(fā)的理解和效率。盡管由于生物制劑開發(fā)平臺，不同公司的流程存在差異，但在關(guān)鍵工藝步驟中仍存在共性。

在調(diào)研中，布魯克的Beacon®單細胞光導系統(tǒng)被廣泛用于工業(yè)CLD實驗室，在單細胞克隆、克隆性確認和在過程早期識別高產(chǎn)細胞方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是該階段應用最多的技術(shù)手段之一。

綜述主要內(nèi)容

調(diào)研覆蓋CLD以下三個主要階段針對性提出問題，共計341個問題：

1. 轉(zhuǎn)染前準備：包括載體設計和構(gòu)建；

2. 轉(zhuǎn)染：涵蓋載體最初轉(zhuǎn)入細胞以及隨后的選擇和Pool的分析；

3. 單細胞克隆和先導克隆選擇：分離單細胞和確認克隆來源的方法、后續(xù)擴增和篩選過程以及識別和儲存最佳克隆的方法。

圖1. 針對CLD的三個不同階的調(diào)研方向描述

包括AbbVie、Bayer、GSK、Janssen、Merck&Co、Novo Nordisk、Pfizer、Takeda、BMS等27家大型制藥和CDMO公司參與調(diào)研（表1）。

表1. 參與調(diào)研的公司調(diào)研結(jié)果顯示出CLD過程的多樣性和共識，指出盡管不同公司采取了不同的方法，但大多數(shù)公司能夠在24至28周內(nèi)完成從基因到主克隆的整個過程。這一時間跨度受到多種因素的影響，包括克隆選擇所需的數(shù)據(jù)量、所承擔的風險程度以及不同平臺方法的效率。作者指出，CLD的關(guān)鍵在于平衡速度與質(zhì)量，確保在追求快速開發(fā)的同時，不犧牲細胞株的性能和穩(wěn)定性。此外，結(jié)論部分也體現(xiàn)了行業(yè)內(nèi)部合作的重要性，BioPhorum作為一個促進知識共享和最佳實踐發(fā)展的平臺，對推動行業(yè)發(fā)展起到了積極作用。

Beacon®平臺是單細胞克隆

和最佳克隆選擇階段的主要工具

單細胞克隆和最佳克隆篩選構(gòu)成了細胞株開發(fā)（Cell Line Development, CLD）流程中兩個密不可分的環(huán)節(jié)，它們通過精細的小規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)和發(fā)酵工藝實現(xiàn)銜接。這一過程不僅耗時較長，且需要巨大的工作量，它涉及將眾多的單個細胞培養(yǎng)成為克隆群體，并通過一系列針對產(chǎn)量、增值速度和穩(wěn)定性、產(chǎn)物質(zhì)量等篩選流程，從數(shù)以千計的候選細胞中篩選出最佳細胞株。

調(diào)研結(jié)果顯示：所有參與調(diào)查的公司在開發(fā)抗體或復雜分子時都會進行單細胞克隆。這也是符合監(jiān)管所要求的重組產(chǎn)品的細胞應從單一細胞祖先克隆而來。大多數(shù)受訪者在克隆之前或期間對轉(zhuǎn)染池進行特性化評估。在進行單細胞克隆時有幾種技術(shù)平臺可供選擇，其中38%的受訪者表示在CLD實驗室在單細胞克隆階段使用Beacon®平臺，是應用最多的技術(shù)路徑（圖2）。

圖2. 用于單細胞克隆的主要設備

在單克隆篩選階段，大約一半的受訪者每個分子篩選多達2000個孔，其余的受訪者篩選4000到10,000個孔，作者認為這些受訪者可能使用了Beacon®或者FACS等高通量的篩選方式。受訪者表示克隆效率存在較大差異，對于表達單克隆抗體的細胞株，克隆效率通常高于表達復雜分子的細胞株。克隆后的細胞需要在不同的培養(yǎng)器皿中擴增，包括微孔板、試管旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器或搖瓶等。大多數(shù)受訪者在篩選克隆時主要考慮生長速度、產(chǎn)量和單克隆性，而較少在單細胞克隆階段篩選產(chǎn)品質(zhì)量。

開發(fā)生產(chǎn)型細胞株的重要步驟之一是分離和擴增單個細胞祖先，并能夠展示高概率或能確保單克隆性。96% 的受訪者在單細胞分離的第0天和之后成長為細胞群體過程進行成像。所有受訪者對于復雜分子的成像方式相同，這表明這一步驟作為克隆性評估的一部分非常重要。許多受訪者不僅僅使用Beacon®進行單細胞克隆，還會用于成像以確保克隆性，這讓Beacon®成為單克隆性確認成像儀器中使用最多的技術(shù)路徑（圖3）。

圖3. 用于單克隆性確認和細胞生長記錄的影像記錄設備

為了提高效率，大多數(shù)受訪者采用了自動化技術(shù)，包括單細胞、平板成像和擴增過程中的克隆挑選。大約三分之一的受訪者在研究細胞庫（RCB）建立前進行穩(wěn)定性評估，而77%的受訪者在主克隆選擇前進行。

從單細胞克隆到最終克隆選擇的預期時間中位數(shù)為17-20周，這個時間包括了發(fā)酵評估、產(chǎn)品質(zhì)量評估和研究細胞庫的準備。一些公司為了加速開發(fā)時間，可能會采取一些風險較高的做法，比如在RCB建立前不進行穩(wěn)定性研究。

Beacon®系統(tǒng)在CLD領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢

Beacon®單細胞光導系統(tǒng)自上市以來其CLD工作流程被諸多國內(nèi)外大型制藥和CDMO企業(yè)采用。Beacon®能夠在短時間完成數(shù)千個單細胞的克隆、克隆性的確認以及基于產(chǎn)量、生長速度和產(chǎn)物質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)克隆篩選，加速藥物生產(chǎn)開發(fā)進程，為后續(xù)生產(chǎn)找到細胞株。

技術(shù)優(yōu)勢

? 出色的單克隆性，獲得監(jiān)管機構(gòu)認可

? 更高篩選通量，找到稀有優(yōu)質(zhì)克隆

? 全自動實驗流程，顯著縮短細胞株開發(fā)周期

? 可靠的定量檢測，與生物反應器更好的相關(guān)性

? 兼顧細胞產(chǎn)率和產(chǎn)物質(zhì)量，篩選高品質(zhì)克隆

? 適用于各種類型生物制劑的細胞株開發(fā)