一、背景

曲霉屬通用PCR試劑盒是一種用于檢測曲霉屬病原體的生物試劑，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。

曲霉屬通用PCR試劑盒具有高靈敏度、特異性強(qiáng)、操作簡便等特點(diǎn)，可用于科研實(shí)驗(yàn)、臨床檢測等領(lǐng)域。通過該試劑盒，用戶可以快速、準(zhǔn)確地檢測曲霉屬病原體，對于曲霉病的診斷和治療具有重要意義。

曲霉屬通用PCR試劑盒是一種用于檢測曲霉屬真菌DNA的PCR試劑盒。該試劑盒通常包括以下成分：

曲霉屬通用PCR試劑盒PCR反應(yīng)液：包括PCR緩沖液、dNTPs、引物、Taq聚合酶等。

標(biāo)準(zhǔn)品：用于定量檢測曲霉屬真菌DNA的濃度。

陰性對照：用于排除假陽性結(jié)果的可能性。

陽性對照：用于確認(rèn)試劑盒的準(zhǔn)確性和可靠性。

使用曲霉屬通用PCR試劑盒時(shí)，首先需要提取樣本中的DNA，然后將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號強(qiáng)度，可以確定樣本中是否存在曲霉屬真菌DNA。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域。

二、曲霉屬通用PCR試劑盒的操作步驟如下

1、樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無菌容器中。

2、DNA提?。簩⒉杉降臉颖具M(jìn)行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下。

3、PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)試劑盒說明書的要求，配制PCR反應(yīng)體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。

4、PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件和時(shí)間根據(jù)試劑盒說明書的要求進(jìn)行設(shè)置。

5、結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測，根據(jù)熒光信號的出現(xiàn)情況判斷是否存在曲霉屬的感染。

三、應(yīng)用

曲霉屬通用PCR試劑盒可以用于15種中藥材表面污染真菌的分離鑒定及產(chǎn)毒性能分析：

通過對不同來源的15種45份中藥材表面污染真菌的分離鑒定,以及對菌株產(chǎn)毒性能進(jìn)行檢測,探索一種中藥材表面污染真菌的快速鑒定方法,為全面了解中藥材真菌污染狀況,實(shí)現(xiàn)中藥材真菌毒素污染的預(yù)警報(bào)告奠定基礎(chǔ)。

方法：

1、中藥材表面真菌的分離、純化與培養(yǎng)利用平板稀釋法,對從廣西、湖南、湖北三個(gè)地區(qū)的零售店購買的15種45份中藥飲片表面污染真菌進(jìn)行分離、純化與培養(yǎng)。

2、菌株的顯微鑒別利用乳酸酚棉藍(lán)染色法對分離得到的菌株進(jìn)行顯微觀察,做初步的鑒定。

3、真菌的分子鑒定選取文獻(xiàn)中常用的真菌鑒定通用引物ITS1/ITS4,以及自行設(shè)計(jì)的ITS引物Wen1F/Wen1R、Wen2F/Wen2R,以分離到的菌株基因組DNA為模板,進(jìn)行曲霉屬通用PCR試劑盒PCR擴(kuò)增,獲得目的片段,測序并進(jìn)行序列比對。

4、菌株產(chǎn)毒性能的檢測根據(jù)顯微觀察和分子鑒定的結(jié)果以及有關(guān)參考文獻(xiàn),對部分菌株進(jìn)行液體培養(yǎng),采用LC-MS/MS方法對其培養(yǎng)物中的赭曲霉毒素A(OTA)及雜色曲霉毒素(ST)檢測。

結(jié)果：

1、中藥材表面分離菌的情況及顯微鑒別結(jié)果在檢測的45份藥材中43份檢出有真菌污染,污染率達(dá)95%,真菌污染情況較為普遍。從實(shí)驗(yàn)的中藥材樣品表面共獲得143株真菌,經(jīng)過初步的形態(tài)學(xué)觀察主要為子囊菌類和半知菌類,其中曲霉屬(Aspergillus spp.),青霉屬(Penicillum spp.)數(shù)量最多,是所測樣品中的主要污染菌屬。湖北樣品中共分離到真菌44株,其中曲霉屬17株,占38%,青霉屬5株,占11%；湖南樣品中共分離到真菌42株,曲霉屬12株,占28%,青霉屬10株,占23%；廣西樣品中共分離到真菌57株,曲霉屬15株,占26%,青霉屬19株,占33%。

2、曲霉屬通用PCR試劑盒分子鑒定結(jié)果利用基于ITS序列的分子鑒定方法對所得的143株真菌進(jìn)行鑒定,117株鑒定到屬以上。曲霉屬共39株,其中雜色曲霉(Aspergillus versicolor)7株,煙曲霉(Aspergillus fumigatus)4株,黃曲霉(Aspergillus fiavus)和棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)各3株；青霉屬共34株；枝孢菌屬(Cladosporium spp.)10株；散囊菌屬(Eurotium spp.)5株；小光殼屬(Leptosphaerulina spp.)3株、鐮刀菌屬(Fusarium spp.)3株；擬青霉屬(Paceilomyces spp.)2株；鏈格孢屬(Alternaria spp.)2株；炭團(tuán)屬(Hypoxylon spp.)2株；其他菌屬17株；另有26株菌株未能準(zhǔn)確分類。

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