子宮內膜著床失敗是不育的重要原因，但目前對于其背后的機制尚不明確，主要是缺乏能夠構建有組織的子宮內膜結構并在體外重現著床過程的技術。

盡管已經有了子宮內膜類器官，但它們僅由上皮細胞構成，且其頂端面向內部，阻礙了胚泡附著。此外，這些類器官被嵌入在細胞外基質（ECM）中，這可能阻礙胚泡與上皮細胞的直接接觸。

(一)構建頂端向外的小鼠子宮內膜類器官的詳細步驟

步驟

操作內容

培養條件

預期結果

1

小鼠子宮組織分離

- 使用膠原酶和DNase I在無Ca2?/Mg2?的PBS中消化30分鐘，37°C水浴，100bpm搖晃

- 用冰冷PBS稀釋至15ml，收集上皮細胞分數

獲得子宮內膜上皮細胞（EECs）和基質細胞（ESCs）的分離物

2

細胞培養

- 將分離的細胞重新懸浮在基礎培養基中，并離心兩次

- 將上皮細胞分數與基質細胞分數混合，接種到12孔培養板中，每孔1ml擴增培養基（不涂任何涂層）

- 37°C，5%CO?培養箱中培養，第1、3、5天更換培養基

細胞開始在培養板邊緣向中心自然聚集，形成環狀結構

3

聚集體的收集與再接種

- 第3天，用1000μl移液管收集環狀聚集體到1.5ml管中，通過剪短的200μl移液管吹打分散成小聚集體

- 將小聚集體重新接種到同一培養皿中

EECs傾向于位于外圍，ESCs占據內部

4

轉移到低黏附培養皿

- 第7天，將每個聚集體分別挑出，并在96孔低黏附U型底培養皿中用擴張培養基培養

- 每兩天更換一次培養基

經過3天懸浮培養（第10天），類器官形成

5

懸浮培養以促進類器官形成

懸浮培養過程中，覆蓋外表面的透明層逐漸增厚，最終包裹整個聚集體

類器官外層由EECs組成，內層由ESCs填充，形成頂端向外的結構

6

激素處理以誘導接受狀態

使用雌二醇（E2）、cAMP和醋酸甲地孕酮（MPA）處理類器官48小時

類器官對激素有響應，可模擬體內子宮內膜的接受狀態

7

與胚泡共培養

將處理后的類器官與從GFP轉基因小鼠獲得的胚泡在低黏附U型底培養皿中共培養

觀察胚泡附著、上皮內陷、吞噬作用和侵入等著床過程

（二）頂端向外的細胞排布是如何實現的？

2.1 利用細胞的自組織特性

- 細胞初始聚集：將子宮內膜上皮細胞（EECs）和基質細胞（ESCs）同時接種到黏附培養板中，在特定的培養基中培養。從第2天開始，細胞會自發聚集，到第3天形成大型環狀結構。這種聚集現象是細胞自組織的初步表現，可能與細胞間的黏附特性有關。

- 細胞類型特異性重排：在第5天，細胞聚集體內部發生了顯著的細胞類型特異性重排，EECs傾向于位于聚集體的外圍，而ESCs則占據內部。這種重排是細胞依據自身特性進行的自我組織過程，可能涉及細胞間的相互識別和信號傳遞。

2.2 懸浮培養促進細胞極性形成

- 透明層的形成與細胞形態變化：將細胞聚集體轉移到低黏附U型底培養皿中進行懸浮培養。在懸浮培養的前3天，覆蓋聚集體外表面的透明層逐漸增厚并最終包裹整個聚集體。這個透明層是由E-鈣黏蛋白陽性的EECs組成的上皮細胞層。同時，扁平的EECs逐漸變成柱狀細胞，細胞高度增加，這表明細胞在懸浮培養過程中發生了形態變化，以適應三維環境并形成頂端向外的結構。

- 細胞表面結構的形成：掃描電子顯微鏡（SEM）觀察顯示，懸浮培養后類器官的整個表面都被光滑的EECs覆蓋，沒有ESCs暴露在外。此外，類器官表面觀察到了微絨毛等頂端結構特征，還發現了類似pinopodes的大型圓頂狀突起，這些結構在體內子宮內膜的腔面上皮細胞中也有表達，進一步證實了EECs的頂端向外取向。

2.3 培養基成分的引導作用

- 特定培養基的使用：在整個培養過程中，使用了專門為子宮內膜類器官培養設計的擴增培養基。這種培養基含有多種成分，如B27、N2、胰島素-轉鐵蛋白-硒（ITS）、尼克酸胺、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子-基礎（FGF-Basic）、Noggin、TGFβ/Alk抑制劑A83-01、R-spondin、WNT3A等，這些成分共同作用，為細胞的生長、分化和極性形成提供了必要的信號和營養支持，引導細胞形成頂端向外的結構。

2.4 培養步驟的協同作用

- 黏附培養與懸浮培養的結合：先在普通培養皿中進行黏附培養，使細胞能夠初步聚集并形成一定的組織結構，然后通過分散和重新接種，再轉移到低黏附培養皿中進行懸浮培養。這種培養方式的轉變對于細胞的自組織和類器官的成熟至關重要，黏附培養為細胞提供了初始的相互作用和組織形成的平臺，而懸浮培養則為細胞的進一步分化和極性形成提供了三維的空間環境，使EECs能夠在外圍形成頂端向外的結構，而ESCs則填充內部。

（三）本文的創新點

3.1 類器官結構設計的創新

- 頂端向外的細胞排布：傳統子宮內膜類器官存在基底向外、頂端向內的極性，導致胚泡無法在體外附著到上皮細胞的頂端表面。而原文作者研究開發的類器官實現了頂端向外的結構，使E-鈣黏蛋白陽性的上皮細胞位于外部，波形蛋白陽性的基質細胞位于內部，成功模擬了體內子宮內膜的細胞排布，為胚泡附著提供了合適的界面。

- 無需嵌入細胞外基質（ECM）：以往的類器官通常需要嵌入ECM如Matrigel中進行培養，這阻礙了胚泡與上皮細胞的直接接觸。原文作者研究的類器官無需ECM嵌入，使上皮細胞暴露，有利于胚泡與上皮細胞的直接相互作用，更真實地模擬體內環境。

3.2 著床過程模擬的創新

- 完整著床過程的重現：在體外成功重現了小鼠胚泡著床的全過程，包括胚泡附著、上皮內陷、細胞吞噬（entosis）和胚泡侵入四個步驟。通過時間序列成像技術，實時觀察到了這些動態過程，為研究著床機制提供了直觀的證據。

- 著床反應的準確模擬：侵入類器官的胚泡衍生細胞表現出類似于滋養層巨細胞的形態和增殖蛋白陽性特征，同時周圍的基質細胞表達了蛻膜化標記物環氧化酶2，這表明類器官能夠準確模擬體內著床過程中的滋養層細胞分化和基質細胞蛻膜化反應。

3.3 類器官形成方法的創新

- 基于細胞自組織的形成機制：利用子宮內膜上皮細胞和基質細胞在黏附培養條件下的自發聚集能力，結合后續的懸浮培養，實現了類器官的自組織形成。這種形成機制不需要外力干預，依靠細胞自身的特性和相互作用，形成了具有特定空間結構的類器官。

- 的培養流程：先將細胞在普通培養皿中進行黏附培養，誘導細胞自發聚集形成環狀結構，再經過分散和重新接種，最后轉移至低黏附培養皿中進行懸浮培養，逐步形成類器官。這一的培養流程有助于細胞的自組織和類器官的成熟。

3.4 激素響應性的創新

類器官對激素處理有明顯的響應，能夠通過調節激素水平誘導類器官進入胚泡接受狀態，顯著提高了胚泡的附著和侵入效率。這種激素響應性對于研究著床過程中的內分泌調節機制具有重要意義，也為未來開發激素治療策略提供了實驗模型。

3.5 對比先前模型的創新

- 克服傳統模型局限性：解決了傳統二維和三維共培養模型在重建子宮內膜結構和模擬著床過程方面的不足，如無法準確模擬子宮內膜的復雜結構和細胞間相互作用等。

- 綜合解決多個問題：雖然此前有研究分別解決了類器官的一些局限性，但本研究同時克服了所有關鍵問題，包括細胞極性、基質細胞的缺失以及ECM的阻礙等，使類器官在模擬體內環境和著床過程方面更加完善。

(四) 技 術 展 望

將頂端向外的小鼠子宮內膜類器官與Kirkstall Quasi Vivo類器官動態灌流培養系統相結合：

4.1 提升類器官的生理功能模擬

- 更真實的營養物質交換：Quasi Vivo系統通過動態灌流模擬體內血管系統，為類器官提供精準的營養物質輸送和代謝廢物清除。與傳統的靜態培養相比，這種動態環境能更真實地模擬體內子宮內膜的營養物質交換過程，使類器官的代謝和功能更接近體內真實狀態。

- 增強細胞間和細胞-基質間相互作用：動態灌流產生的流體剪切力可以促進細胞間的信號傳遞和相互作用，模擬體內復雜的生物力學環境。同時，系統提供的三維培養支持結構有助于類器官維持更好的形態和細胞外基質的形成，從而增強細胞與基質之間的相互作用，進一步提升類器官的生理功能模擬。

4.2 改善類器官的長期培養與穩定性

- 延長類器官活性：在靜態培養條件下，類器官在長時間培養過程中容易出現營養不良、代謝產物積累等問題，導致細胞活力下降和組織結構破壞。而Quasi Vivo系統的動態灌流能夠持續提供新鮮的培養基，及時清除代謝廢物，有助于維持類器官的長期活性和穩定性，延長其可使用時間。

- 促進類器官的成熟與分化：動態培養環境為類器官的成熟和分化提供了更理想的條件。細胞在持續的營養供應和適宜的生物力學刺激下，能夠更好地完成其正常的生理功能和分化過程，使類器官的組織結構和功能更加完善，從而更準確地模擬體內子宮內膜的生理狀態。

4.3 增強類器官與胚泡相互作用的準確性

- 更精準的激素調節：Quasi Vivo系統可以精確控制培養環境中的激素濃度和動態變化，模擬體內復雜的內分泌調節過程。在研究胚泡著床過程中，通過動態調節激素水平，可以更精確地研究不同激素對胚泡與類器官相互作用的影響，深入了解著床過程中的內分泌調節機制。

- 更真實的機械力環境：系統模擬的體內流體環境所產生的機械力，如剪切力等，可以影響細胞的黏附、遷移和分化等過程。在胚泡與類器官相互作用中，這些機械力可能對胚泡的附著和侵入等步驟產生重要影響。通過結合Quasi Vivo系統，可以更好地研究機械力在著床過程中的作用，為揭示其背后的分子機制提供新的視角。

4.4 推動疾病模型研究與藥物篩選

- 更準確的疾病模型模擬：在研究子宮內膜相關疾病（如子宮內膜異位癥、子宮內膜癌等）時，結合Quasi Vivo系統的頂端向外小鼠子宮內膜類器官可以更準確地模擬疾病發生發展的微環境。動態灌流培養能夠反映疾病狀態下復雜的生理病理變化，為研究疾病的發病機制提供更可靠的模型。

- 高通量藥物篩選平臺的構建：Quasi Vivo系統具有良好的擴展性和可重復性，通過將多個類器官培養模塊連接在一起，可以構建高通量藥物篩選平臺。在這種平臺上，可以同時測試多種藥物對子宮內膜類器官的影響，快速篩選出具有潛在治療效果的藥物，為開發新的治療策略提供有力支持。

公司主營產品：

Kilby 3D-clinostat 旋轉細胞培養儀，

Kilby Gravite微/超重力三維細胞培養系統，

3D回轉重力環境模擬系統，隨機定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall 類器官串聯芯片灌流仿生構建系統