Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells

Keywords: Autophagy; Glaucoma; Mechanical stress; PI3K; Primary cilia; Trabecular meshwork.

眼壓升高（IOP）是青光眼的主要危險因素，其是由于房水（AH）通過小梁網（TM）/施萊姆管（SC）流出通道組織的引流障礙，導致眼壓穩態中斷。流出通道中的細胞持續受到機械力的影響，如拉伸應力和剪切應力，分別是由 IOP 和 AH 流量的每日波動引起。研究表明，TM 和 SC 細胞能夠通過各種生理反應感知和響應這些機械應力，這被認為是維持 IOP 穩態所必需的內在適應機制。

自噬的激活是一種適應性反應，初級纖毛（PC）是拉伸和剪切應力誘導的 TM 和 SC 細胞中自噬的關鍵機械傳感器。初級纖毛作為細胞的信號樞紐，參與多種細胞內信號轉導通路。研究發現，PC 依賴性拉伸誘導的自噬是由人 TM（HTM）細胞中 AKT 和 SMAD2/3 信號之間的一種新型相互激活機制介導的。然而，上游信號轉導組件仍然難以捉摸。

磷酸磷脂酰肌醇（PIPs）是在真核細胞膜中發現的必需磷脂，是各種細胞過程中膜蛋白的關鍵調節因子，包括自噬。PIPs 由磷脂酰肌醇（PI）的第3、第4 和第5  位磷酸化產生，有7 種不同的 PIPs 衍生物。在第三位磷酸化的 PIPs  [PI（3）P、PI（3,5）P2 和 PI（3,4,5）P3] 參與自噬誘導和吞噬泡的形成。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一種可使PI環上第3 位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，其結構可分為3 種類型（I 類、II 類和 III 類）。研究表明，I 類 PI3K 調節 AKT 和 SMAD2/3 信號，并促進剪切應力誘導的 SC 細胞自噬。

最近，在美國杜克大學眼科中心及斯坦福大學醫學院眼科團隊的一項研究中，探索了 PI3Ks 和 PIPs 作為上游信號成分在機械拉伸的 HTM 細胞中 PC 依賴性自噬激活中的作用，研究報道了 PIK3CA-INPP4A/B 參與機械應力下的自噬激活以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。研究成果發表于 Cellular and Molecular Life Sciences  期刊題為“Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells”。

為了研究 I 類 PI3Ks 是否構成響應機械拉伸 TM 細胞中介導自噬激活的上游成分，首先分析了 PI3K 家族所有不同成員的催化亞基的 mRNA 表達水平。利用針對流出通道的單細胞 RNA 測序數據庫的數據，發現 TM 細胞中 PI3Ks 催化亞基的 5 種亞型在 mRNA 水平上顯著表達：IA 類 [PIK3CA（11.82%）、B（5.76%）和 D （3.75%）]、II 類 [PIK3C2A（18.59%）] 和 III 類 [PIK3C3（14.27%）]。

使用 PIK-75 對 I 類 PI3Ks 進行藥理學抑制，濃度遞增的 PIK-75（20 nM-2 μM）處理 HTM 細胞，隨后應用循環機械拉伸（CMS，20% 或 8%應變，1 Hz）。2 μM 的 PIK-75 處理降低了 CMS 誘導的 LC3 II 水平升高（圖1 A）。

最近一項關于造血干細胞的研究表明，PIK3CA、B 和 D 一起缺失，而不是單獨或成對缺失，會破壞自噬。為了研究這種可能性，使用針對 PIK3CA、B 和 D 的 siRNA 對 IA 類 PI3Ks 的催化亞基進行單次或三次敲低，并評估機械拉伸細胞中的 LC3 II 水平。WB 分析顯示，與對照細胞相比，經三重敲低的細胞中 CMS 誘導的 LC3 II 顯著降低（圖1 B）。與先前在造血干細胞中的發現一致，每個基因的單次敲除并不能阻止CMS誘導的LC3 II水平增加。

進一步研究證實，在用表達 RFP-GFP-LC3（Ad-tfLC3）的腺病毒轉導的 HTM 細胞中抑制 I 類 PI3Ks 可防止 CMS 誘導的自噬體形成。與之前的研究一致，在 2 μM PIK-75 處理的CMS 刺激細胞中觀察到自噬數據（自噬體：黃色點；自噬溶酶體：紅色點）有質的增加（圖1 C）。這些發現表明，I 類 PI3K 催化亞基通過促進自噬體的形成在調節 CMS 誘導的自噬中發揮作用。

圖1     抑制 IA 類 PI3Ks 可防止 CMS 誘導的 HTM 細胞自噬。

接下來，研究了 II 類和 III 類 PI3K 是否也有助于 TM 細胞中拉伸誘導的自噬激活。為此，沉默了 HTM 細胞中 PIK3C2A 的表達，并評估了 CMS 后的 LC3 II 水平，發現PIK3C2A敲低并不能阻止CMS 作用下TM 細胞中 LC3 II 的增加。此外，III 類 PI3K（PIK3C3）的敲低并未抑制 CMS 誘導的 TM 細胞自噬激活。這些結果表明，II 類 PI3Ks 和 III 類 PI3Ks 均未顯著促進 TM 細胞中拉伸誘導的自噬激活。

進一步研究 I 類 PI3Ks 在 HTM 細胞中 PC 上的定位。研究人員專注于 IA 類 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3D），因為它們是 TM 細胞中表達強烈的亞型。使用針對每種 I 類 PI3K 亞型的催化亞基的抗體以及乙酰化 TUBA4A（Ac-TUBA4A（一種 PC 標志物）進行免疫共染色。結果顯示，PIK3CB 或 PIK3CD 在 PC 上沒有顯著的共定位。相比之下，PIK3CA 與 PC 表現出很強的共定位性（圖2 A）。有趣的是，在暴露于循環機械拉伸的細胞中，PC 上 PIK3CA 的強度水平顯著降低（圖2 B）。這些結果表明，PIK3CA 定位于 PC 上，并在 CMS 處理的 HTM 細胞中與 PC 解離。

圖2     PIK3CA 在 PC 上的定位及其在CMS 處理的 HTM 細胞中與 PC 的解離。

上述結果表明，I 類 PI3Ks 在 CMS 誘導的自噬中的作用。據報道，I 類 PI3Ks 與 PI 磷酸酶活性相結合，為 T 細胞中自噬的啟動提供 PI（3）P。因此，研究了由 I 類 PI3Ks 和 PI 磷酸酶產生的 PI（3）P 是否參與 CMS 誘導的 TM 細胞自噬。

首先，研究了 I 類 PI3Ks 參與 PC 的 PI（3）P 產生情況。為此，敲低所有三種 IA 類 PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3CD）的表達，并對 PI（3）P 和 PC 標志物 ARL13B 進行共免疫染色，發現在 PC 和胞質囊泡內觀察到 PI（3）P 染色（圖3 A）。正如預期的那樣，I 類 PI3K 活性降低的細胞表現出 PI（3）P 染色的整體降低。定量分析證實，在 I 類 PI3K 敲低后，PC 處的 PI（3）P 水平顯著降低，支持 I 類 PI3Ks 在纖毛 PI（3）P 產生中的作用（圖3 B）。值得注意的是，在機械拉伸的細胞中未觀察到 PC 上 PI（3）P 產生的顯著差異。

圖3    PIK3CA、B 和 D 的三重敲低降低了 HTM 細胞中 PC 上 PI（3）P 的強度。

I 類 PI3Ks 主要產生 PI（3,4）P2 和 PIP3，然后轉化為 PI（3）P。PI（3,4）P2 和 PIP3 都與 AKT 的普列克底物蛋白同源（PH）結構域結合。為了檢測 PI（3,4）P2 或 PIP3，使用生物傳感器質粒AKT-PH-GFP 轉染 HTM 細胞并進行 CMS 處理。有趣的是，共聚焦顯微鏡顯示在質膜上檢測到 AKT-PH-GFP 信號，并在細胞內囊泡中積累（圖4 A）。響應 CMS 后，每個細胞的 AKT-PH-GFP 陽性囊泡數量顯著增加（圖4 A）。共免疫染色進一步揭示了這些囊泡與網格蛋白重鏈（CLTC）的部分共定位（圖4 B），表明囊泡是通過網格蛋白介導的內吞過程形成的。

最后，實驗旨在確定 I 類 PI3K（PIP3 或 PI（3,4）P2）產生的哪些 PIPs 轉化為 PI（3）P 以在 CMS 下啟動吞噬泡的形成，以及與之相關的磷酸酶。為此，使用 siRNA 對 SHIP1 和 SHIP2（介導 PIP3 轉化為 PI（3,4）P2的5’ PI 磷酸酶）或 INPP4A 和 INPP4B（介導 PI（3,4）P2 轉化為 PI（3）P的 4' PI 磷酸酶）進行了雙重敲低，并進行 CMS 測量 LC3 II 水平。結果顯示，敲低 INPP4A/B ，但不是 SHIP1/2，顯著降低了 TM 細胞中 CMS 誘導的 LC3 II 增加（圖4 C）。此外，使用 AS1949490 對 SHIP1/2 進行化學抑制，在濃度遞增的情況下，并沒有降低 CMS 誘導的 LC3 II 水平。共定位研究 AKT-PH-GFP 和 LC3 標記點之間的部分共定位或接觸，表明 I 類 PI3Ks 產生的 PIPs 可能有助于自噬體的生物發生。這些發現表明，I 類 PI3Ks 與 INPP4 磷酸酶一起在 CMS 誘導的TM 細胞自噬中起直接作用。

圖4     在 HTM 細胞 CMS 期間 PI（3,4）P2 陽性囊泡對自噬的調節。

總之，該研究描述了 PIK3CA-INPP4A/B 在機械應力下自噬激活中的作用以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。未來需要進一步的研究來了解哪些 IA 類 PI3Ks 調節自噬降解的機制，以及通過機械力調節 IA 類 PI3K 激活的上游信號。在 TM 機械感覺中具有已知功能的強候選者是整合素和 G 蛋白偶聯受體（GPCRs）。了解青光眼中的這些通路及其潛在改變，包括 I 類 PI3K 的改變，可以提供新的治療策略來恢復 IOP 穩態。

參考文獻：Shim MS, Sim EJ, Betsch K, Desikan V, Su CC, Pastor-Valverde D, Sun Y, Liton PB. Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells. Cell Mol Life Sci. 2025 Feb 22;82(1):82. doi: 10.1007/s00018-025-05615-x. PMID: 39985671; PMCID: PMC11846827.

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