雙熒光素酶試劑盒
MCE 國際站：Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit
品牌：MedChemExpress (MCE)
存儲條件： -20℃ 一年避光保存，避免反復凍融
簡介：MCE Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit 含有高純度的 D-熒光素、腔腸素以及比例優化的反應緩沖液，實現哺乳動物細胞雙螢光素酶報告基因檢測。
概述：雙熒光素酶報告基因檢測系統包括螢火蟲熒光素酶 (Firefly Luciferase，firLuc)和海腎熒光素酶 (Renilla Luciferase，rLuc)。在ATP和熒光素酶存在下，D-熒光素 (D-Luciferin)能夠被氧化，發出波長為 570 nm 左右的生物螢光 (bioluminescence) (圖1)。當熒光素過量時，發光亮度與熒光素酶濃度呈正相關，廣泛用于熒光素酶報告基因的檢測。在 O2 存在條件下，海腎熒光素酶 (Renilla Luciferase)可以將腔腸熒光素(coelenterazine)氧化成腔腸酰胺 (coelenteramide)，并發出波長為 480 nm 左右的生物螢光 (圖2)。海腎熒光素酶作為雙熒光素酶報告基因的內參，消除了細胞生長狀態、數量、轉染效率等差異的影響，使得檢測結果的準確性更高。本試劑盒中含有高純度的D-熒光素、腔腸素以及比例優化的反應緩沖液。在雙熒光素酶反應中，首先用 Firefly Luciferase Working Solution (含D-熒光素)檢測螢火蟲熒光素酶信號；隨后，直接加入 Renilla Luciferase Working Solution (含腔腸素)，將螢火蟲熒光素酶的信號猝滅，同時產生海腎熒光素酶信號。本試劑盒具有操作簡單、檢測快捷、靈敏度高等優點。
描述：
MCE 海腎-螢火蟲熒光素酶雙聯檢測試劑盒含有高純度 D-熒光素、腔腸素和專有反應緩沖液。首先將螢火蟲熒光素酶工作液加入樣品中。該試劑含有可產生螢火蟲熒光素酶生物發光的 D-熒光素。接下來，將海腎熒光素酶工作液加入同一樣品中。它會猝滅螢火蟲熒光素酶生物發光并產生海腎熒光素酶生物發光。兩種反應的光產生量均可方便地在光度計上測量。
操作說明：1. 配制試劑1.1 Lysis Buffer (1×) 的配置將 Lysis Buffer (5×) 用超純水稀釋 5 倍，配置成 1× 工作液。1.2 螢火蟲熒光素酶工作液 (Firefly Luciferase Working Solution)的配置將 Firefly Luciferase Substrate 干粉管短暫離心后開蓋，加入 1 mL Firefly Luciferase Buffer 將其全部溶解并混合均勻，然后將全部溶液移入剩余的 9 mL Firefly Luciferase Buffer 中，混勻。1.3 海腎熒光素酶工作液 (Renilla Luciferase Working Solution)的配置將 Renilla Luciferase Substrate 短暫離心后開蓋，加入 1 mL Renilla Luciferase Buffer 混合均勻，然后將全部溶液移入剩余的 9 mL Renilla Luciferase Buffer 中，混勻。注1：所有試劑使用前需平衡至室溫。注2：螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶工作液配制完成后，分裝、避光保存，避免反復凍融，-80℃可保存一年，-20℃可保存一個月。2. 裂解細胞2.1 細胞裂解時密度應小于 95%，細胞生長過密，易導致裂解不充分。質粒瞬轉、病毒感染細胞后，需培養一段時間 (一般 48 小時)使熒光素酶充分表達。2.2 去除培養基，用 PBS、生理鹽水或無血清培養液洗 1 遍，注意不要將細胞吹起。2.3 加入適量的 1× Lysis Buffer，用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。2.4 將細胞培養板置于搖床上，室溫、輕晃孵育 15 分鐘。注：細胞數量較高時，可適當加大裂解液用量、延長裂解時間。2.5 將裂解物轉移到新的離心管中，4℃、12,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清備用。3. 熒光檢測3.1 取 20 μL 細胞裂解物，加至 96 孔黑色不透底酶標板中。3.2 檢測螢火蟲熒光素酶信號取 100 μL 平衡至室溫的螢火蟲熒光素酶工作液加至上述反應板中，混勻后，用酶標儀測定螢火蟲熒光素酶信號。3.3 檢測海腎熒光素酶信號取 100 μL 平衡至室溫的海腎熒光素酶工作液加至上述反應板中，混勻后，用酶標儀測定海腎熒光素酶信號。3.4 結果分析在以海腎螢光素酶為內參的情況下，用螢火蟲螢光素酶所得發光值除以海腎螢光素酶所得發光值。根據得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。注：為了確保實驗結果準確性，螢火蟲熒光素酶 (fLuc) 和海腎熒光素酶 (rLuc) 的發光值均應為相對發光值 (RLU, relative light unit)。
注意事項：1. Luminometer 發光計或者多功能酶標儀或者其他能夠檢測生物發光的儀器均適用于此試劑盒。2. 螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶工作液配制完成后，分裝、避光保存，避免反復凍融，-80℃ 可保存一年，-20℃ 可保存一個月。3. 發光強度以及衰減速率取決于熒光素酶的反應速率。溫度對酶反應速率有直接影響，兩種螢光素酶活性的最適溫度約為室溫 (20-25℃)，檢測時請將樣品與反應試劑平衡至室溫。4. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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