輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要?dú)涫荏w，生成的NADH 經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成 ATP 的同時(shí)，形成大量的ROS，同時(shí) NADH 再生為NAD⁺。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD⁺比值的高低可用于評價(jià)糖酵解和TCA 循環(huán)的強(qiáng)弱。較高的 NAD(H)及NADH/NAD⁺比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA 循環(huán)。另外，NAD⁺降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD⁺和NADH，NADH 通過PMS 的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測吸光值；而 NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為 NADH，進(jìn)一步采用 MTT還原法檢測

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒   輔酶Ⅰ系列

組成：

試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存，用時(shí)加入 3ml 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周；試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時(shí)加入 3ml 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周；

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

NAD+和 NADH 的提取：

1、 血清（漿）中 NAD⁺和NADH 的提取

NAD⁺的提取：按照血清（漿）體積（ml）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿），加入 1ml 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提取：按照血清（漿）體積（ml）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1ml

血清（漿），加入 1ml 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織中NAD⁺和NADH 的提取：

NAD⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加入 1ml 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加入 1ml 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD⁺和NADH 的提取：

NAD⁺的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：酸性提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：堿性提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在 1.5ml 棕色EP 管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置 5min 后，20000g，25℃離心 5min，棄上清，沉淀中加入：混勻，取 200μl 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下讀取對照吸光值A1 和測定管吸光值 A2，計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng):

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若NAD+測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 測定中△A（A2-A1）≤0.0222，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時(shí)間 20min 延長到 60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。

5、由于每一個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管，本試劑盒 100 管保證測 48 個(gè)NAD⁺或NADH.

NAD+和 NADH 含量的計(jì)算:

（一） NAD⁺含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1475x + 0.0302，R² = 0.9978；其中y 為△A，x 為NAD⁺濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NAD⁺含量計(jì)算

NAD⁺含量(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD⁺含量計(jì)算 (1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

NAD⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NAD⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）

（二）NADH 含量的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1404x + 0.0222，R² = 0.9976；其中y 為△A，x 為NADH 濃度nmol/ml 1、血清（漿）中 NADH 含量計(jì)算

NADH 含量(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計(jì)算

NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0.1ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

注意：zui低檢測限為 0.1nmol/ml 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot

輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒   輔酶Ⅰ系列