丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK)試劑盒說(shuō)明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是C4 途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化 ATP、丙酮酸和 Pi 經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于 C4 植物的葉綠體基質(zhì)中，對(duì)光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

測(cè)定原理：

PPDK 的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP 和PPi 生成丙酮酸、ATP 和Pi，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化丙酮酸和NADH 生成乳酸和NAD+，在 340nm 測(cè)定NADH 減少速率，計(jì)算PPDK 活性。

丙酮酸磷酸雙激酶試劑盒 光合系列

組成：

試劑三 ：液體 40μl×1 支，4℃保存；體積較少，若沾在管壁上，臨用前可低速離心后使用。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟和加樣表：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1） 工作液的配制：臨用前取試劑二一瓶加入 10ml 試劑一和 5μl 試劑三，充分混勻，置于 37℃水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處初始吸光值A1 和 37℃反應(yīng) 5min 后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PPDK 活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=643×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=1286×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

丙酮酸磷酸雙激酶試劑盒 光合系列