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   ASMS2020 賽默飛線上預(yù)熱講座集錦第三期：蛋白組學(xué)新技術(shù)與熱點

疫情并不能停止分析科學(xué)家們技術(shù)交流與分享，6月1-12日，質(zhì)譜界盛會—第68屆美國質(zhì)譜年會，在線上盛大舉行。在此之前，賽默飛舉辦了線上預(yù)熱講座，內(nèi)容涵蓋LC-MS新產(chǎn)品，以及蛋白組學(xué)、生物制藥、代謝組學(xué)等應(yīng)用方向，所有內(nèi)容現(xiàn)在仍可通過注冊進(jìn)行線上觀看。

上一期，與大家分享了Surequant靶標(biāo)定量新方法，這一期繼續(xù)與大家分享講座中涉及的蛋白組學(xué)新技術(shù)與熱點。

Prosit: 組學(xué)水平的深度學(xué)習(xí)譜圖預(yù)測

傳統(tǒng)的質(zhì)譜搜索引擎在匹配理論與實驗譜圖（PSM）時，不考慮離子強度、碎裂能量等實驗信息。而在DIA方法中，二級譜碎片離子強度以及母離子保留時間對匹配準(zhǔn)確性至關(guān)重要。來自德國慕尼黑大學(xué)的科學(xué)家Bernhard Kuster系統(tǒng)介紹了Prosit譜圖預(yù)測算法。通過對數(shù)據(jù)庫中高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)的學(xué)習(xí)，建立深度學(xué)習(xí)模型可以很好地預(yù)測二級譜圖以及保留時間等信息。

通過深度學(xué)習(xí)對碎片保留時間和離子強度進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。A, Prosit深度學(xué)習(xí)機制。B, Prosit用于預(yù)測碎片離子強度;  C, 碰撞能量校準(zhǔn)的碎片強度預(yù)測與實際肽段譜圖更接近（點擊查看大圖）

在DDA中用實驗譜圖與預(yù)測譜圖進(jìn)行匹配打分，也可以大大提高對target肽段的檢出能力（FDR=1%），據(jù)Küster介紹，F(xiàn)DR會低10~100倍。作者在多個實驗中驗證了Prosit對多肽二級譜以及保留時間的預(yù)測準(zhǔn)確性，并展示這種預(yù)測能力極大地提高了搜索質(zhì)量，可以使傳統(tǒng)的target-decoy搜庫方法得到非常大的進(jìn)步。
 

Prosit深度學(xué)習(xí)機制提升DDA數(shù)據(jù)的解析結(jié)果。A, Prosit強度預(yù)測提高數(shù)據(jù)庫檢索的可信度；B，Prosit可以在宏蛋白質(zhì)組大數(shù)據(jù)搜索空間中實現(xiàn)更可靠的鑒定;  C，Prosit預(yù)測也適用于非胰酶酶切肽段尤其是單電荷肽段，提升對HLA peptide的解析結(jié)果。（點擊查看大圖）

傳統(tǒng)DIA在建立實驗譜庫時往往要耗費大量的質(zhì)譜時間，也不能涵蓋樣品中所有肽段的譜圖信息。作者希望通過Prosit深度學(xué)習(xí)機制可以準(zhǔn)確預(yù)測二級譜圖及保留時間，直接用于DIA的建庫，只需要提供理論肽段序列信息就可以構(gòu)建任何物種的譜圖數(shù)據(jù)庫，可用于多個DIA以及Proteome Discoverer 2.5軟件分析。

Prosit深度學(xué)習(xí)機制用于DIA分析。A, Prosit可準(zhǔn)確預(yù)測保留時間；B，Prosit與多個DIA分析軟件合作; C，Prosit也將可以在PD2.5軟件檢索流程中使用。（點擊查看大圖）

單細(xì)胞蛋白組學(xué)的“食譜”

01

單細(xì)胞分析的重要性

異質(zhì)性：常規(guī)蛋白組學(xué)一般為基于細(xì)胞群體的研究，這樣的常規(guī)分析不可避免會將大量細(xì)胞內(nèi)的信息平均化。而在腫瘤研究以及生殖發(fā)育等重要的生物學(xué)過程中都涉及異質(zhì)性。

樣品量受限的樣品：例如具有高活力和轉(zhuǎn)移潛能的CTC細(xì)胞（循環(huán)腫瘤細(xì)胞），外泌體，細(xì)針穿刺和活檢組織切片樣品等。

02

單細(xì)胞分析流程優(yōu)化

單細(xì)胞蛋白組分析中大的難點是樣品量極少。而常規(guī)蛋白組樣品前處理方法僅適用于大量細(xì)胞樣品的處理；使用常規(guī)反應(yīng)體系時酶解效率低；樣品濃度很低（單細(xì)胞樣品）時，同樣降低酶解效率。因此，單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析中，無法直接使用常規(guī)蛋白組學(xué)的方法，而是需要對每個過程進(jìn)行優(yōu)化。該講座中給出了一個單細(xì)胞蛋白組學(xué)的專屬“食譜”。

其中樣品前處理，色譜分離和質(zhì)譜分析部分的細(xì)節(jié)內(nèi)容可參見“美夢成真——單細(xì)胞蛋白組分析的進(jìn)化之路”，在此詳細(xì)討論講座中的單細(xì)胞獲取和如何提高樣品前處理方法易用性。

03

如何獲取單細(xì)胞

Ø  顯微操縱獲取單細(xì)胞
 

FACS獲取單細(xì)胞需要一定的細(xì)胞起始量，在總細(xì)胞數(shù)不多的情況下，可通過顯微操縱獲取單細(xì)胞[1]。在顯微鏡的輔助下，使用毛細(xì)管直接從細(xì)胞懸浮液中吸取單個細(xì)胞至nanoPOTS中進(jìn)行后續(xù)操作。

Ø  熒光激活細(xì)胞分選術(shù)FACS
 

nanoPOTS芯片，與FACS（熒光激活細(xì)胞分選）以及LC-MS聯(lián)用用于單細(xì)胞蛋白組分析[2]。

Ø  激光捕獲顯微切割LCM
 

結(jié)合nanoPOTS樣品前處理平臺與LCM（激光捕獲顯微切割）的蛋白組成像[3]。

04

提高樣品前處理方法易用性

除了開發(fā)樣品前處理方法之外，研究人員也希望通過提高前處理方法的易用性，可以將該方法推廣至更多的實驗室。

Ø  適當(dāng)提高反應(yīng)體系，

應(yīng)用商品化的微量移液器

在nanoPOTS的樣品前處理過程中，需要使用自制的移液機器人吸取幾十 nL級別的液體，并對操作人員的實驗技巧有一定的要求。因此，研究人員比較了使用稍大的反應(yīng)體積，例如幾百nL級別（μPOTS）時的分析結(jié)果[4]，此時可使用商品化的一些微量移液器即可完成移液。在少于100個細(xì)胞的樣品中也能獲得不錯的蛋白和肽段鑒定結(jié)果。

Ø  改造較低成本的移液機器人
 

可將商品化的低成本移液機器人改造成可配置微量注射器，可用于nL級別的移液，并進(jìn)行后續(xù)的樣品前處理。

將單細(xì)胞蛋白分析轉(zhuǎn)變成常規(guī)分析還需要很長的路要走，TMT多重標(biāo)記、微流控液滴技術(shù)、高靈敏度的納升色譜柱、Orbitrap Exploris 480 及具有實時檢索功能的Orbitrap Eclipse儀器以及FAIMS Pro接口勢必會加速單細(xì)胞蛋白組的進(jìn)化路程。

后一期中，我們會繼續(xù)和大家分享線上預(yù)熱講座中生物制藥的精彩內(nèi)容，敬請期待。

參考文獻(xiàn)

[1] Anal. Chem. 2020, 92, 2665−2671

[2] Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57: 12370-12374

[3] Nature Communicaitons, 2020, 11:8

[4] Analytical and Bioanalytical Chemistry volume, 2019, 411: 4587–4596

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