ASMS2020賽默飛線上預熱講座集錦第四期：生物大分子表征新技術
飛飛 賽默飛Orbitrap組學俱樂部 今天
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疫情并不能停止分析科學家們技術交流與分享，6月1-12日，質譜界盛會—第68屆美國質譜年會，在線上盛大舉行。在此之前，賽默飛舉辦了線上預熱講座，內容涵蓋LC-MS新產品，以及蛋白組學、生物制藥、代謝組學等應用方向，所有內容現在仍可通過注冊進行線上觀看。
前三期，與大家分享了新儀器的應用，蛋白組學的新技術與熱點，這期與大家分享講座中的生物大分子表征新技術。
多樣化液相串聯質譜技術用于完整分子量表征
近年來，隨著非變性質譜技術的日趨成熟，生物大分子完整分子量表征方法的多樣性也隨之增加，如色譜及電泳技術與質譜聯用等方法。
非變性質譜進行完整分子量分析的主要優勢包括：
1色譜高通用性；
2分析速度快且樣品使用量小；
3質譜的高分辨性能及出色的峰容量可獲得高質量質譜圖。
非變性質譜已被工業界快速接受，作為完整水平的質量屬性監測強有力的分析方法。此外，非變性質譜也能夠在表征實驗室與QC實驗室之間建立強大的關聯。本講座介紹了完整分子量分析的技術重點及方法的穩健性，包括不同質譜平臺間方法轉換對數據的影響（從Q Exactive plus到Exploris 480）。
賽默飛完整分子量分析平臺包括Vanquish Duo雙三元超高效液相、Exploris 480超高分辨質譜、變色龍數據管理系統，及Protein Metrics數據分析軟件。
圖.賽默飛完整分子量分析平臺（點擊查看大圖）
01
SEC平臺
在線SEC-MS作為簡單且穩健的分析平臺，可實現高通量生物大分子聚集體分析。Vanquish Duo液相平臺可以使用兩根色譜柱同時進行分析和再平衡，當一根色譜柱在分析時，另一根色譜柱在平衡，可以大程度節約分析時間，提高分析通量。
圖.Vanquish Duo實現高通量分析（點擊查看大圖）
經過液相分離得到的每個色譜峰經過質譜檢測，能夠獲得對應的單體及聚體的分子量及糖型信息。同時，orbitrap的超高分辨性能可實現每個糖型的基線分離，在非變性條件下得到更準確的分子量信息。方法穩健性的測試，連續進樣413次，每24次進一針參比品，17針參比品的色譜疊加圖顯示保留時間及色譜峰的RSD值在3%以內。不同實驗室使用不同批次SEC色譜柱，多次技術重復實現結果顯示，單體及聚體的糖型含量保持一致，具有良好的重現性。
圖.非變性質譜平臺的穩健性（點擊查看大圖）
02
質譜平臺轉移
將非變性質譜平臺從QE Plus轉移至Exploris 480上，并做了方法驗證和對比。Exploris 480，45K分辨率時，可在保證高信噪比的同時實現好的分辨率，能夠分辨相差25Da的兩個糖基化修飾峰，可作為Exploris 480分析完整蛋白時合適的分辨率。上樣量從1ug到10ug遞增，譜圖均有良好的信噪比，且糖型相對含量一致。
圖.Exploris 480分辨率和上樣量參數優化（點擊查看大圖）
QE Plus及Exploris 480的質譜數據（多樣本且技術重復）對比顯示，在完整水平上鑒定的糖型及含量高度一致，證實了方法轉移的可行性（如下圖所示）。
圖.QE Plus及Exploris 480數據對比（點擊查看大圖）
03
CIEX平臺
通過使用可揮發性鹽流動相及PH梯度分離，可實現在線CIEX-MS分析，如下圖a所示，對于多種單抗混合樣品，可獲得良好的色譜分離及高質量質譜數據（可分辨相差幾十Da的糖化修飾峰）。穩定性實驗中，通過CIEX-MS分析，能夠觀測到堿性峰中的琥珀酰亞胺中間體產物的增加（圖b）；加速穩定性實驗中，能夠觀測到抗體片段的變化（圖c）。
圖a.CIEX-MS分析多種單抗混合物（點擊查看大圖）
圖b.CIEX-MS分析抗體穩定性實驗中的堿性峰變化（點擊查看大圖）
圖c.CIEX-MS分析抗體加速穩定性實驗中的片段峰變化（點擊查看大圖）
總結
生物大分子完整分子量分析在工業界已是一種廣泛認可的分析方法，多樣性的前端液相串聯質譜（如反相，離子交換，體積排阻色譜等）平臺已被開用應用。基于orbitrap的質譜平臺能夠獲得更高分辨及穩健性的數據，且能夠在不同orbitrap質譜型號間進行方法轉換。對于完整蛋白糖型表征，抗體片段分析，琥珀酰胺化修飾、氧化修飾等雜質能夠進行高通量且準確分析。
PRCR技術與MS3在抗體Middle-down蛋白分析中的應用
ASMS 2019，賽默飛重磅推出三合一系列的創新dian峰之作——Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™質譜儀，*的PTCR技術可通過氣相的離子-離子相互作用，將蛋白質的質子轉移給特定的化合物（C??F??），從而造成蛋白質本身電荷減少，得到一系列的電荷減少離子。
采用Middle-down質譜分析減少了樣品前處理操作，降低了人為引入翻譯后修飾的風險，可以更好的獲取抗體的序列信息。結合使用PTCR技術后，通過降低母離子和/或子離子的價態，幫助解析復雜的MS及MS?譜圖，可檢測到更多的母離子及碎片，對結構生物學以及生物制藥的應用大有助益。
講座中簡要介紹PTCR技術結合MS3與SPS同步母離子掃描技術在Middle-down蛋白分析中的應用。PTCRMS3分析策略如下，方法設置中shou選會用四極桿選擇某一價態的母離子，隨后根據方法設置按照不同的碎裂模式，如ETD，HCD，UVPD進行二級碎裂，產生的碎片離子與PTCR離子發生三級反應，獲得的碎片離子進入Orbitrap進行質量分析。
以NIST mAb為例，進行middle-down分析前，先使用Ides酶對單抗進行酶切，然后將單抗還原成LC，Fd，Fc三條分子量約為25kDa的亞基。以分子量大的Fd的序列覆蓋結果為例，單獨使用ETD的Fd序列覆蓋度為52%。ETD碎裂模式結合PTCR-MS3可以將序列覆蓋度提高至63%，同時使用PTCR后對于分子量大于5kDa的碎片識別率有了顯著的提高。
PTCR與HCD碎裂模式聯合使用時，同樣也會提高鑒定效率。以Fd為例，PTCR-MS3雖然只是略微增加了Fd的序列覆蓋度，但是互補離子對的數量有了顯著增加，從0對增加到了7對。結合兩者的數據可以將序列覆蓋度增加到41.6%，同時互補離子對增加到8對。
PTCR與UVPD聯合使用時，可以將LC的序列覆蓋度從64.6%提高至74%。將單用UVPD和PTCR聯用的結果整合，則可以將LC的序列覆蓋度提高至84.4%，互補離子對的數量也有了顯著增加。
常規的PTCR-MS3分析會將二級碎片按照質荷比進行分段，成為兩個質譜分析方法，分多針進樣分析。為了減少進樣數量，在一針方法里實現多段質量軸的二級碎片的PTCR反應，可結合SPS同步母離子掃描技術。以UVPD碎裂為例，將SPS窗口設置為目標質量范圍，實現一針進樣，多段分子量的PTCR分析。
SPS結果顯示，優化了PTCR和UVPD反應時長后，可以實現LC 54%的序列覆蓋，雖然不及多針進樣模式下的結果，但仍然可以看出SPS技術應用在PTCR分析中，減少進樣數量、縮短進樣時間的可能性。
總結
Eclipse上*的PTCR（質子轉移電荷減少）技術可以將蛋白上的質子轉移給特定離子，簡化蛋白分析中原本十分復雜的質譜圖。聯合PTCR與其他碎裂模式（ETD，HCD，UVPD），使二級碎片與PTCR離子發生三級反應，降低碎片譜圖的復雜程度，可增加抗體蛋白middle-down分析的序列覆蓋度。
學習使人快樂，通過四期的分享，希望大家都能從中獲得快樂。
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