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Anti-YFP 親和凝膠

MCE 國際站：Anti-YFP Affinity Gel

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲條件：4℃，2 年禁止凍結

簡介：MCE Anti-YFP 親和凝膠可用于檢測和純化 YFP 及其融合蛋白，結合和純化 GFP 和 EGFP 標簽蛋白，不結合 BFP 和 RFP 標簽蛋白，也可用于免疫沉淀 (IP) 實驗。

概述：黃色熒光蛋白 (Yellow Fluorecent Protein，YFP) 來源于維多利亞多管發光水母 (Aequorea Victoria)，是綠色熒光蛋白 (GFP) 的突變體 (T203Y)，熒光向紅色光譜偏移，發出黃色熒光。作為熒光蛋白標簽，可直接定位目的基因在細胞中的定位，將其作為報告基因已廣泛應用于細胞生物學和分子生物學領域。MCE Anti-YFP 親和凝膠由高品質的 YFP 抗體與瓊脂糖共價偶聯制成，具有高載量、高特異性和性質穩定等特點，可用于檢測和純化 YFP 及其融合蛋白，結合和純化 GFP 和 EGFP 標簽蛋白，不結合 BFP 和 RFP 標簽蛋白，也可用于免疫沉淀 (IP) 實驗。本產品每 1 mL 總體積中 0.5 mL 為凝膠。使用前，需將凝膠充分重懸混勻后吸取。

描述：

黃色熒光蛋白 (YFP) 源自維多利亞水母，是綠色熒光蛋白 (GFP) 的突變變體 (T203Y)。該突變使其熒光發射向紅色光譜移動，發出黃色熒光。YFP 已廣泛用作細胞生物學和分子生物學領域的報告基因。

MCE 抗 YFP 親和凝膠是通過將高品質 YFP 抗體與瓊脂糖共價偶聯而產生的。它具有高負載能力、高效的特異性和穩定性。該凝膠可用于檢測和純化 YFP 及其融合表達蛋白。它還可有效結合和純化帶有 GFP 和 EGFP 標記的蛋白質，但它不與帶有 BFP 或 RFP 標記的蛋白質結合。此外，它還可用于免疫沉淀 (IP) 測定。

操作說明：蛋白純化樣品在上樣前建議離心或用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過濾，減少雜質，提高蛋白純化效率。1. 中壓層析柱法1) 裝柱：將 Anti-YFP 親和凝膠裝入合適的層析柱中，連接層析柱與色譜系統。2) 柱平衡：用 5 倍柱體積的結合緩沖液清洗進行柱平衡。重復 2-3 次。3) 上樣：利用泵或樣品環上樣，收集流出液，可以反復上樣提高結合效率。注：a. 請根據蛋白量選擇合適凝膠量，上樣量避免超過柱子的結合能力； b. 樣品粘度或體積增加可能會造成層析柱反壓。4) 洗雜：使用 10-20 倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗柱子，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液，直至紫外吸收基線趨于平衡。5) 洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液進行洗脫，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：使用 5 倍柱體積洗脫緩沖液洗脫層析柱再生填料，再用洗滌緩沖液平衡層析柱至中性。注：酸性洗脫后填料要立即用結合緩沖液平衡，Anti-RFP 親和凝膠在洗脫液中不要超過 20 min。7) 保存：使用 5-10 倍柱體積凝膠儲存緩沖液平衡層析柱，卸下層析柱，置于 2-8℃保存。2. 重力柱法1) 裝柱：依照所需純化的樣品量，取適量 Anti-YFP 親和凝膠混懸液加入重力層析柱中，去除保護液。2) 柱平衡：使用 5 倍柱體積的結合緩沖液對已裝填好的重力層析柱進行柱平衡。重復 2-3 次。3) 上樣：樣品加入后至少保留 5 min，以保證樣品與介質充分接觸，收集流出液。注：反復上樣可提高結合效率。4) 洗雜：使用 10-15 倍柱體積的洗滌緩沖液進行洗雜，以去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜流出液。5) 洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液進行洗脫，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。6) 再生：使用 5-10 倍柱體積洗脫緩沖液洗脫層析柱再生填料，再用洗滌緩沖液平衡層析柱至中性。注：酸性洗脫后填料要立即用結合緩沖液平衡，Anti-YFP 親和凝膠在洗脫液中不要超過 20 min。7) 保存：使用 5 倍柱體積凝膠儲存緩沖液平衡層析柱，置于 2-8℃保存。3. 離心法1) 填料預處理：依照所需純化的樣品量，取適量 Anti-YFP 親和凝膠混懸液加入離心管中，5,000 g 離心 1 min，棄上清。加入 5 倍凝膠體積的結合緩沖液清洗，5,000 g 離心 1 min，棄上清，重復 2-3 次。2) 結合：加入樣品，封閉離心管，4°C 孵育 2-4 h (或 37°C 孵育 0.5-2 h)。3) 洗滌：孵育完成后，5,000 g 離心 1 min，棄上清 (上清可保留作為流穿液，用于電泳鑒定)。使用 5 倍凝膠體積的洗滌緩沖液清洗，5,000 g 離心 1 min，棄上清，重復 3-5 次。4) 洗脫：使用 3-5 倍柱體積的洗脫緩沖液進行洗脫，室溫孵育 5-10 min，5,000 g 離心 1 min，分管收集并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。可重復 2-3 次并分別收集上清液。注：a. 酸性洗脫后填料要立即用結合緩沖液平衡，Anti-YFP 親和凝膠在洗脫液中不要超過 20 min。b. 洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。5) 再生及保存：使用 5-10 倍凝膠體積的洗滌緩沖液沖洗介質，再用 5-10 倍凝膠體積的 ddH2O 沖洗，最后使用 2 倍凝膠體積的凝膠儲存緩沖液沖洗，置于 2-8°C 保存。免疫沉淀 IP1. 凝膠預處理1) 將 Anti-YFP 親和凝膠重懸混勻，吸取 40 μL 凝膠懸液（約 20 μL 凝膠）至干凈的 1.5 mL 離心管中，5,000 g 離心 1 min，棄上清。2) 加入 500 μL 結合緩沖液，混合均勻，5,000 g 離心 1 min，棄上清。重復 2-3 次。2. 樣品結合1) 在上述清洗干凈的凝膠中加入 200-1,000 μL 樣品。充分混勻后，置于翻轉混合儀上孵育，4℃ 孵育 2 h。如需提高結合效率，可過夜孵育。注：對于易降解的蛋白，建議添加蛋白酶抑制劑。2) 5,000 g離心 1 min，將上清轉移至新離心管 (上清液可用于檢測 YFP 標簽蛋白是否有殘留)。3. 洗滌在上述分離得到的凝膠中加入 500 μL 洗滌緩沖液，充分混懸凝膠，5,000 g m 離心 1 min，棄去上清。重復以上洗滌步驟 3 次以上，直到洗滌后的上清液中 OD280 小于 0.05 為止。注：多次洗滌的目的是確保去除非特異性吸附，如上清液的 OD280 大于 0.05，可增加洗滌次數。4. 洗脫提供兩種洗脫方案，可根據需要選擇不同的洗脫方案。1) 酸性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 50-100 μL 洗脫緩沖液，充分混勻后室溫孵育 5 min，5,000 g離心 1 min，收集上清并立即用中和液緩沖液中和 pH （總洗脫液體積的 1/10），樣品可用于后期功能分析。注：洗脫后蛋白短期可 4℃ 存放，若要長期存放建議置于 -20℃ 中。2) 變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測。在上述洗滌干凈的凝膠中加入 20-50 μL 2× SDS-PAGE Loading Buffer，充分混勻后 95℃ 加熱 5 min。5000 g離心 1 min，取上清進行 SDS-PAGE 電泳檢測。注：由于常規 SDS-PAGE Loading Buffer 中含有 β-疏基乙醇和 DTT會使填料中抗體輕重鏈斷開，同時含有 SDS 的 Loading Buffer 可以使介質配體變性，因此變性洗脫后的 Anti-YFP 親和凝膠不能重復使用。

注意事項：1. 本產品使用前務必充分重懸凝膠。2. 使用本產品進行 IP 實驗前，需先確認樣品中 YFP 標簽蛋白的表達情況。3. 為最大限度的降低蛋白質降解，請配合使用 MCE 蛋白酶抑制劑 cocktails (MCE 貨號 HY-K0010，HY-K0011)。4. 不要使用含有 DTT 的細胞裂解液樣品，DTT 可能會引起凝膠上的 YFP 抗體脫落。5. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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