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Cell Counting Kit-8

MCE 國際站：Cell Counting Kit-8

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲條件：4°C 一年-20°C 兩年長期保存，建議避光

簡介：Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8試劑盒或CCK8試劑盒，是一種基于WST-8而廣泛應用于細胞活性和細胞毒性檢測的快速、高靈敏度試劑盒。

概述：Cell Counting Kit-8，簡稱 CCK-8 試劑盒，是一種基于 WST-8 而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。CCK-8 溶液可以直接加入到細胞樣品中，不需要預配各種成分。WST-8 在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan (參考圖1) 。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺 (生成的formazan 量) 和細胞目呈線性關系 (圖2) WST-8 是 MTT 的一種升級替代產品，和 MTT 或其它 MTT 類似產品，如 XTT、MTS 等相比有明顯的優點。第一，MTT被線粒體內的一些脫氫酶還原生成的 formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶劑來溶解；而 WST-8 和 XTT 、MTS 產生的 formazan 都是水溶性的，可以省去后續的溶解步驟。第二，WST-8 產生的 formazan 比 XTT 和 MTS 產生的 formazan 更易溶解。第三，WST-8 比 XTT 和 MTS 更加穩定，使實驗結果更可靠。第四，WST-8 和 MTT、XTT 等相比線性范圍更寬，靈敏度更高，并且更加穩定。WST-8 對細胞無明顯毒性。加入 CCK-8 溶液顯色后，可以在不同時間反復用酶標儀讀板，檢測時間更加靈活，便于確定最佳測定時間。

描述：

細胞計數試劑盒-8 (CCK-8) 是一種用于研究任何體外模型中細胞增殖誘導和抑制的工具。細胞計數試劑盒-8 (CCK-8) 利用高度水溶性的四唑鹽，可以進行非常方便的檢測。WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑單鈉鹽] 在電子介體存在下還原后產生水溶性甲臜染料。

CCK-8 是一種一瓶即用型溶液。 CCK-8 不具有放射性，因此可以進行靈敏的比色測定，以測定細胞增殖和細胞毒性測定中的活細胞數量。

1. 比 MTT、MTS 或 WST-1 更靈敏

2. 對細胞無毒性

3. 步驟簡單（無需解凍）

4. 一瓶溶液穩定：4°C 下保存 1 年

操作說明：本試劑盒可以用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生長抑制檢測。1. 制作標準曲線a. 先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞；b. 按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 5-7 個細胞濃度梯度，每組 4-6 個復孔；c. 接種后培養 2-4 小時使細胞貼壁，然后每 100 μL 培養基加 10 μL CCK-8 試劑培養一定時間后測定 OD 值，制作出一條以細胞數量為橫坐標，OD 值為縱坐標的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量。使用此標準曲線的前提條件是試驗條件一致。2. 細胞活性檢測a. 在 96 孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養板放在培養箱中預培養 24 小時；b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產生氣泡) ；c. 將培養板置于培養箱內孵育 1-4 小時；d. 用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。3. 細胞增殖-毒性檢測a. 在 96 孔板中接種細胞懸液 (100 μL/孔) ，將培養板放在培養箱中預培養 24 小時；b. 向培養板加入不同濃度的待測藥物；c. 將培養板在培養箱孵育一段適當的時間；d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產生氣泡)；e. 將培養板置于培養箱內孵育 1-4 小時；f. 用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。4. 計算公式細胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%As: 實驗孔吸光度 (含細胞、培養基、CCK-8 溶液和藥物溶液) ；Ac: 對照孔吸光度 (含細胞、培養基、CCK-8 溶液，不含藥物) ；Ab: 空白孔吸光度 (含培養基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物) 注：如果待測藥物有氧化性或還原性，可在加入 CCK-8 之前更換新鮮培養基，去掉待測藥物的影響。當待測藥物影響比較小的情況下可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入待測藥物后的空白吸收即可。

注意事項：1. CCK-8 的培養時間一般為 1-4 小時，但在培養 30 分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度，根據細胞種類而定，需要摸索條件CCK-8 的最佳反應時間以具體顯色的最佳時間為準。2. 使用 96 孔板進行檢測時，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發問題。一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的 PBS 、水或培養液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。3. 本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，所以還原劑 (例如一些抗氧化劑) 會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。 用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。4. 加入藥物中如含有金屬，對 CCK-8 顯色有影響。終濃度為 1 mM 的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制 5% 、15% 、90% 的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是 10 mM 的話，將會 100% 抑制。5. 培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。6. 本產品可以檢測 ，但不能檢測酵母細胞。向 100 μL 培養液中加入 10 μL CCK-8 溶液，并培養 1-4 小時或過夜。7. CCK-8 試劑對細胞的毒性非常低。它和活細胞內的脫氫酶持續反應使溶液顏色不斷加深，OD 值不斷增加 (注: 活細胞內的脫氫酶是持續產生的) 。8. 要測定細胞的具體數量，建議同時做標準曲線。9. 建議采用多通道移液器，以減小平行孔間的差異。10. 以下方法可以終止 CCK-8 反應 (96 孔板) ：(a). 在顯色反應后，將培養板放置 4°C 冰箱內。(b). 每孔加 10 μL 0.1 M HCl溶液。(c). 每孔加 10 μL 1% (w/v) 的 SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。注意：反應停止后，應在 24 小時內測定。11. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。12. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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